1、傳代保存法：有些微生物當遇到冷凍或干燥等處理時(shí)，會(huì )很快死亡，因此在這種情況下，只能求助于傳代培養保存法。傳代培養就是要定期地進(jìn)行菌種轉接、培養后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生產(chǎn)菌種的保存。

傳代保存時(shí)，培養基的濃度不宜過(guò)高，營(yíng)養成分不宜過(guò)于豐富，尤其是碳水化合物的濃度應在可能的范圍內盡量降低。培養溫度通常以稍低于最適生長(cháng)溫度為好。若為產(chǎn)酸菌種，則應在培養基中添加少量碳酸鈣。

一般地，大多數菌種的保藏溫度以5℃為好，像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37℃進(jìn)行保存，而蕈類(lèi)等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。

傳代培養保存法雖然簡(jiǎn)便，但其缺點(diǎn)也很明顯，如：①菌種管棉塞經(jīng)常容易發(fā)霉；②菌株的遺傳性狀容易發(fā)生變異；③反復傳代時(shí)，菌株的病原性、形成生理活性物質(zhì)的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期轉種，工作量大；⑤雜菌的污染機會(huì )較多。          

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2、液體石蠟覆蓋保存法：該法較前一種方法保存菌種的時(shí)間更長(cháng)，適用于霉菌、酵母菌、放線(xiàn)菌及需氧細菌等的保存。此法可防止干燥，并通過(guò)限制氧的供給而達到削弱微生物代謝作用的目的。其具有方法簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也適用于不宜冷凍干燥的微生物（如產(chǎn)孢能力低的絲狀菌）的保存，而某些細菌如固氮菌、乳酸桿菌、明串珠菌、分枝桿菌、紅螺菌及沙門(mén)氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克銀漢霉、毛霉、根霉等不宜采用此法進(jìn)行保存。

3、懸液保存法：即使微生物混懸于適當溶液中進(jìn)行保存的方法。常用的有，

① 蒸餾水保存法：適用于霉菌、酵母菌及絕大部分放線(xiàn)菌，將其菌體懸浮于蒸餾水中即可在室溫下保存數年。本法應注意避免水分的蒸發(fā)。

② 糖液保存法：適用于酵母菌，如將其菌體懸浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗處保存，可長(cháng)達10年。除此之外，也可使用緩沖液或食鹽水等進(jìn)行保存。

4、載體保存法：即將微生物吸附在適當載體上進(jìn)行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種，如

① 土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏。方法是在滅菌的土壤中加入菌液，立即在室溫下進(jìn)行干燥或使菌體繁殖后再干燥，然后冷藏或在室溫下密封保存。保存用的土壤原則上以肥沃的耕土為宜，土壤需風(fēng)干、粉碎、過(guò)篩和滅菌。

使微生物在土壤中繁殖后進(jìn)行干燥保存的方法是：取適量土壤（5克）置于塞有棉塞的試管中，加水或加入充分稀釋的液體培養基（以含水量為土壤最大持水量的60%為宜），然后高壓滅菌。再將需保存的微生物進(jìn)行大量接種，培養至菌絲能用肉眼確認的程度為止，移入干燥器中經(jīng)短時(shí)間干燥或風(fēng)干后密封，冷藏或室溫保存。

② 砂土保存法：取清潔的砂，過(guò)60目篩去掉大砂粒，并用磁鐵吸去砂中鐵屑，再用NaOH溶液、10% HCl溶液和水交替清洗數次，干燥后，置于試管或安瓶管中保持2～3cm深，再經(jīng)干熱滅菌后，加入1ml菌種培養液，經(jīng)充分混勻后，放入真空干燥器中，完全干燥后熔封保存。也可用二份洗凈的砂（經(jīng)HCl預處理）和一份貧瘠、過(guò)篩的黃土攙和后滅菌，再進(jìn)行菌種保藏。

③ 硅膠保存法：以6～16目的無(wú)色硅膠代替砂子，干熱滅菌后，加入菌液。加菌液時(shí)，由于硅膠的吸附熱常使溫度升高，因而需設法加以冷卻。

④ 磁珠保存法：將菌液浸入素燒磁珠（或多孔玻璃珠）后再進(jìn)行干燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的硅膠（或無(wú)水CaSO4），上鋪玻璃棉，再放上10～20粒磁珠，經(jīng)干熱滅菌后，接入菌懸液，最后冷藏、室溫保藏或減壓干燥后密封保藏。本法對酵母菌很有效，特別適用于根瘤菌，可保存長(cháng)達兩年半時(shí)間。

⑤ 麩皮保存法：在麩皮內加入60%的水，經(jīng)滅菌后接種培養，最后干燥保藏。

⑥ 紙片（濾紙）保存法：將滅菌紙片浸入培養液或菌懸液中，常壓或減壓干燥后，置于裝有干燥劑的容器內進(jìn)行保存。

5、寄主保存法：即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。

6、冷凍保存法：適用于抗凍力強的微生物。這些微生物可在其菌體細胞外遭受凍結的情況下而不受損傷，而對其它大多數微生物而言，無(wú)論在細胞外凍結還是在細胞內凍結，都會(huì )對菌體造成損傷，因此當采用這種保藏方法時(shí)，應注意以下幾點(diǎn)，

① 要選擇適于冷凍干燥的菌齡細胞；

② 要選擇適宜的培養基，因為某些微生物對冷凍的抵抗力，常隨培養基成分的變化而顯示出巨大差異；

③ 要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也越長(cháng)；

④ 最好在菌液內不添加電解質(zhì)（如食鹽等）；

⑤ 可在菌液內添加甘油等保護劑，以防止在冷凍過(guò)程中出現菌體大量死亡的現象。同樣，也可添加各種糖類(lèi)、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護效果的溶劑，但對有些微生物而言，不加保護劑時(shí)更有效。

⑥ 原則上應盡快進(jìn)行冷凍處理，但當加入保護劑時(shí)，可靜置一段時(shí)間后再進(jìn)行處理。

⑦ 就動(dòng)物細胞而言，應在－20℃范圍內以1℃/min左右的速度緩慢降溫，此后必須盡快降到貯藏溫度；而對絕大多數微生物而言，則不必如此，如結構較為復雜的原蟲(chóng)則可在－35℃范圍內進(jìn)行緩慢降溫，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進(jìn)行冷凍；

⑧ 若進(jìn)行長(cháng)期保存，則貯藏溫度越低越好；

⑨ 取用冷凍保存的菌種時(shí)，應采取速融措施，即在35～40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來(lái)說(shuō)，則應選擇靜置融化的措施。當冷凍菌融化后，應盡量避免再次冷凍，否則菌體的存活率將顯著(zhù)下降。

常用的冷凍保存法包括：

① 低溫冰箱保存法（－20℃、－50℃或－85℃）：低溫冷凍保存時(shí)使用螺旋口試管較為方便，也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時(shí)菌液加量不宜過(guò)多，有些可添加保護劑。此外，也可用φ5mm的玻璃珠來(lái)吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器內，再放入低溫冰箱內進(jìn)行保存的。

② 干冰保存法（－70℃左右）：即將菌種管插入干冰內，再置于冰箱內進(jìn)行冷凍保存。

③ 液氮保存法（－196℃）：是適用范圍最廣的微生物保存法。其操作步驟如下，

a、裝安瓶管：使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當防凍劑（保存霉菌不用防凍劑）的滅菌溶液中，將0.2～1ml的這種溶液分裝于安瓶中，或在裝有分散劑的安瓶中直接接種，或將菌絲體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。

b、熔封安瓶管：若直接貯存于氣相液氮中（－150℃～－170℃）時(shí)，則不需熔封。

c、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下，將熔封安瓶管在適當的色素溶液中浸泡2～30分鐘后，觀(guān)察有無(wú)色素進(jìn)入安瓶。

d、緩慢冷卻：將熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮氣以約1℃/min的速度冷卻至－25℃左右，也可在－20℃～－25℃的冰箱內緩慢冷卻30～60min。

e、速冷：最后浸入液氮中快速冷卻至－196℃。

7、冷凍干燥保存法：其原理是首先將微生物冷凍，然后在減壓下利用升華現象除去水

分。事實(shí)上，從菌體中除去大部分水分后，細胞的生理活動(dòng)就會(huì )停止，因此可以達到長(cháng)期維持生命狀態(tài)的目的。該方法適用于絕大多數微生物菌種（包括噬菌體和立克次氏體等）的保存，其過(guò)程如圖6-1所示。

在進(jìn)行冷凍干燥時(shí)，需注意以下幾個(gè)問(wèn)題：

a、冷凍干燥前的培養條件：首先檢驗菌種純度。一般地說(shuō)，將待保存的微生物在營(yíng)養豐富且容易增菌的培養基上進(jìn)行培養為宜；菌齡以達到對數生長(cháng)期為好；若為有芽孢或孢子的微生物，則以芽孢和孢子形成以后進(jìn)行保存為好；菌液濃度以高為好，如細菌應達到109～1010/ml。

b、菌株號碼等的標記：可在安瓶外側標記或在安瓶?jì)确馊霕撕灐?

c、安瓶的準備：將安瓶在2%HCl中浸泡過(guò)夜，自來(lái)水沖洗3次后，蒸餾水刷凈，干燥，塞棉塞，貼標簽，干熱滅菌或溫熱滅菌后，60℃恒溫干燥。

d、添加保護劑：常用的保護劑有脫脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等等。

8、Bordelli氏法：取干凈的小試管（8×60mm）塞上棉塞，滅菌。用滅菌的脫脂牛乳洗脫試管斜面上的菌苔，制成濃厚菌懸液。然后用無(wú)菌吸管將菌懸液滴入小試管底部。每管一滴，然后轉動(dòng)小試管使菌液分散在試管底部的壁上。標記菌名。將小試管裝在15×150mm的試管中，在大試管底部事先裝上1.5cm高的（P2O5或KOH），管口用帶玻璃管的橡皮塞塞緊，蠟封。將大試管與真空泵連通，抽真空至0.1～0.2mm汞柱時(shí)，將玻璃管熔封，置室溫暗處或冰箱保存。

本文關(guān)鍵詞：菌株的保藏方法