1.  為什么免疫后沒(méi)有效價(jià)或免疫后效價(jià)低？

答：可以從這幾個(gè)方面一一考慮：

（1）設計的抗原與被免疫的動(dòng)物內源蛋白有極高的同源性或者抗原是免疫原性極差的小分子物質(zhì)。對于前一種情況應該重新設計抗原，設計抗原時(shí)盡量選取目標蛋白特異性的序列，可以設計為短肽然后再與載體蛋白偶聯(lián)之后免疫；對于后一種情況，首先確認小分子物質(zhì)是否已經(jīng)正確地和載體蛋白偶聯(lián)，如果偶聯(lián)沒(méi)有問(wèn)題，可以更換其它的載體蛋白，一般來(lái)說(shuō)KLH是所有載體中較為優(yōu)先考慮的蛋白。

（2）免疫的周期不正確。免疫周期過(guò)長(cháng)或過(guò)短，各免疫步驟之間的間隔過(guò)長(cháng)或過(guò)短都有可能影響免疫效果，詳細請參考本站有關(guān)動(dòng)物免疫的部份，實(shí)際操作中的相關(guān)程序與本站推薦的程序相差盡里不超過(guò)50%的偏差。

（3）免疫佐劑不合適。TiterMax等佐劑在免疫時(shí)，對于某些抗原可能效果不佳，弗低佐劑也不能保證完全有效，此時(shí)可以考慮更換佐劑嘗試。

（4）免疫劑量不合理。過(guò)大的免疫劑量可能導致免疫耐受，過(guò)少的免疫劑量可能無(wú)法激活免疫應答。一般來(lái)說(shuō)，實(shí)際免疫劑量與本站所推薦的劑量不要相差兩倍以上。

（5）免疫途徑不合理。對于有些免疫原性弱的抗原，可以考慮脾內免疫方法，具體操作本站上也有詳細的講解。

（6）測效價(jià)的過(guò)程存在錯誤操作，尤其考慮包被是否成功或二抗使用是否正確。同時(shí)，一抗（即血清）稀釋梯度盡量放寬，一般建議從1：500或1：1000開(kāi)始作梯度稀釋。對于小分子物質(zhì)，效價(jià)達到1：2000仍可視為免疫成功。

2.  為什么融合后細胞不長(cháng)或者融合后克隆很少？

答：可以從這幾個(gè)方面考慮：

（1）免疫用的動(dòng)物品系不正確或者品系不純。免疫用的動(dòng)物一般應該與骨髓瘤來(lái)源的動(dòng)物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤細胞時(shí)應該選用Balb/C小鼠，同時(shí)必須使用品系純正的小鼠。

（2）培養基中加入了過(guò)高濃度的HAT，或者僅A的濃度過(guò)高或HT的濃度過(guò)低，建議用純的骨髓瘤和已有的雜交瘤作HAT濃度篩選。

（3）培養基不正確或血清濃度不正確或使用了劣質(zhì)血清。

（4）未正確制備飼養層細胞。參見(jiàn)本站有關(guān)飼養層細胞制備的部份。

（5）接種雜交瘤細胞的培養板過(guò)多。一般在5-20塊96孔板為宜。

（6）融合后，未及時(shí)轉移或稀釋細胞。有人在做融合后喜歡把融合的細胞先放在培養瓶中培養，然后再滴到96孔板上。如果在培養瓶中培養的時(shí)間過(guò)長(cháng)，也可能出現克隆利率少的情況。

（7）細胞被污染。在顯微鏡下仔細觀(guān)察是否有明顯的微生物污染。即使看不到有明顯的微生物，也應該考慮是否有支原體污染，有條件的可以做支原體檢測。

（8）細胞培養條件不正確，確保細胞培養在恒定的37度較濕的環(huán)境，同時(shí)保證CO2濃度在4-5%左右。

（9）其它與融合條件相關(guān)的不恰當的因素。詳見(jiàn)本站有關(guān)細胞融合的部份。

3.  為什么融合后得不到陽(yáng)性克??？

答：可能的原因：

（1）動(dòng)物未免疫成功就進(jìn)行了融合。具體解決方法參照本頁(yè)面第1個(gè)問(wèn)題。

（2）融合后得到的克隆較少，故得到陽(yáng)性克隆的機率也較小。具體解決方法，請參照本頁(yè)面第2個(gè)問(wèn)題。

（3）篩選克隆手段不正確。例如有些小分子物質(zhì)不可以直接包被到酶標板上，再如使用了不適當的二抗等諸多因素，也有人直接不使用ELISA作為篩選方法的，成功率也有待商榷。

（4）抗原成份與細胞培養條件中的物質(zhì)相同或類(lèi)似，或者與篩選過(guò)程中有同抗原結構相同或類(lèi)似的物質(zhì)產(chǎn)生了競爭反應。舉個(gè)簡(jiǎn)單的例子，如果需要制備抗BSA 的單抗，則養雜交瘤的培養基中不可以使用牛血清，否則牛血清中的BSA直接與抗體相結合，最后做ELISA篩選的時(shí)候無(wú)法得到陽(yáng)性結果。解決的辦法只有使用其它的動(dòng)物的血清或者使用無(wú)血清培養基。再如，如果需要制備酪蛋白的單抗，則做ELISA篩選時(shí)，二抗的稀釋液不可以使用脫脂奶粉。

（5）其它所有能影響ELISA等相關(guān)篩選手段的因素。這一部份詳見(jiàn)本站有關(guān)ELISA實(shí)驗的講解與討論。

4.  為什么我的細胞生長(cháng)很慢？

答：可能的原因：

（1）使用了劣質(zhì)的培養耗材、培養基、血清、HAT或HT。建議新手使用知名廠(chǎng)商的試劑或耗材。對于血清，可能需要從多個(gè)廠(chǎng)家選用多個(gè)批次試用，選擇出比較好的批次進(jìn)行實(shí)驗。在試用血清的時(shí)候，一般可以使用相對較低濃度的血清進(jìn)行骨髓瘤細胞培養實(shí)驗，根據骨髓瘤細胞的倍增速度確實(shí)血清質(zhì)量。

（2）使用的血清或培養基濃度不正確。仔細檢查配方是否正確。

（3）制備飼養層的方法不正確。參見(jiàn)本頁(yè)面第二個(gè)問(wèn)題。

（4）其它問(wèn)題，可以參考本頁(yè)面第二個(gè)問(wèn)題。

5.  我的克隆原來(lái)是陽(yáng)性的，為什么后來(lái)轉為陰性了？

答：首先要注意的是，正常情況下，雜交瘤也不是絕對穩定的，確實(shí)容易發(fā)生染色體丟失的情況，尤其是當細胞移到新環(huán)境中生長(cháng)，如從小孔擴大到大孔，或者復蘇操作時(shí)，更容易發(fā)生陽(yáng)性變?yōu)殛幮?。但是也有一些辦法盡量減少陽(yáng)性變?yōu)殛幮缘霓k法。一般可以從這幾個(gè)方面加以注意：

（1）永遠保證細胞處在最佳的生長(cháng)環(huán)境中。尤其是培養基不能長(cháng)期不換，一般來(lái)說(shuō)，當細胞增長(cháng)到一定密度的時(shí)候，培養基就開(kāi)始變顏色，這個(gè)時(shí)候就要準備換培養基了，除了換培養基，同時(shí)應該控制好細胞的密度，可以吹走過(guò)多的細胞，使新加入的培養基不至于很快被消耗。

（2）對于重要的細胞株，每一步都把陽(yáng)性的細胞保種。

（3）不要過(guò)于頻繁操作細胞，當細胞生長(cháng)密度不是很大的時(shí)候，不要頻繁操作，否則細胞容易出現死亡或者生長(cháng)形態(tài)發(fā)生明顯變化。

（4）對于傳代次數較多的細胞株需要經(jīng)常進(jìn)行亞克隆，并將每一次的亞克隆株也作凍存。

（5）當細胞被支原體等微生物污染，也會(huì )發(fā)生由陽(yáng)性轉為陰性的情況。

6.  為什么我做亞克隆后長(cháng)不出克隆來(lái)？

答：亞克隆失敗的原因和克隆不長(cháng)的原因類(lèi)似，但是除此之外，也還有一些獨特的原因。

（1）亞克隆時(shí)，原始孔里的細胞狀態(tài)不好，經(jīng)過(guò)有限稀釋或其它手段亞克隆的細胞活性很差，以至于長(cháng)不出克隆。

（2)亞克隆時(shí)，沒(méi)有按照正確的數量取出細胞，在本站有關(guān)亞克隆操作的頁(yè)面上提到過(guò)，亞克隆的過(guò)程服從泊松分布，如果取出的細胞遠遠低于平均每孔一個(gè)細胞，或有效細胞遠遠低于平均每孔一個(gè)細胞，則也可能出現長(cháng)不出克隆的結果。

（3）未添加飼養層細胞。單個(gè)細胞在完全培養基中極難培養，如果不添加飼養層細胞，則它們很可能很快就死亡，最終就長(cháng)不出克隆。

（4）使用的HAT中HT失效或A的濃度過(guò)高，或者未添加HT。 雖然HT對雜交瘤的生長(cháng)并不是必須的，但是HT確實(shí)可以加快細胞生長(cháng)，改善細胞生長(cháng)狀態(tài)。

（5）使用無(wú)血清培養基。這一點(diǎn)是很冷僻的一個(gè)因素。雖然很少有人使用無(wú)血清培養基制備單抗，但是在某些血清可能干預篩選步驟的實(shí)驗的時(shí)候，可能會(huì )選用無(wú)血清培養基來(lái)培養雜交瘤，但是需要注意的是，在很多種無(wú)血清培養基中，單個(gè)細胞是很難長(cháng)成克隆的。最好的解決辦法就是先用含有血清的培養基培養它們，等克隆長(cháng)出后再把培養基徹底更換為無(wú)血清培養基。

7.  為什么我凍存的細胞很難復蘇或者復蘇不活？

答：這個(gè)問(wèn)題要從兩個(gè)方面來(lái)回答，一是凍存方面，二是復蘇問(wèn)題。 對于凍存過(guò)程，需要注意：

（1）凍存液的配方。這個(gè)問(wèn)題很關(guān)鍵，一個(gè)良好的凍存液配方可以使細胞保存得非常好，而一個(gè)不好的凍存液配方可能會(huì )讓細胞傾刻死亡。目前認為比較好的配方有：10%DMSO+90%胎牛血清和10%DMSO+90%養過(guò)雜交瘤的培養基，不管是哪一種，凍存保護劑DMSO的含量非常重要，如果這個(gè)濃度過(guò)低，則起不到保護作用，凍存的細胞最終會(huì )死于冰晶形成時(shí)的張力，如果濃度過(guò)高，則細胞中毒而亡。如果使用第二個(gè)配方，注意一定要用養過(guò)雜交瘤的培養基，而盡量不要用一般的完全培養基，而且一定是配養需要凍存的那一株的培養基。文獻中也有提到用甘油作為凍存保護劑的，站長(cháng)自己沒(méi)有親自試過(guò)，不發(fā)表評論。如果新手確實(shí)對這個(gè)沒(méi)把握，市場(chǎng)上也有商品化的凍存液，買(mǎi)回來(lái)按照說(shuō)明書(shū)操作就OK了。

（2）凍存過(guò)程中，不可用力過(guò)大，在凍存液中重懸細胞的時(shí)候更是要輕柔，因為在DMSO存在的條件下，細胞膜變得非常脆弱，如果用力過(guò)猛，則細胞膜很容易破，復蘇成活的機會(huì )就明顯會(huì )下降。

（3）凍存的程序也非常重要。實(shí)踐表明，以每分鐘1 ℃的速度下降凍存細胞是最理想的。如果條件簡(jiǎn)易，可以把細胞放在4 ℃半小時(shí)左右，然后再在-20 ℃放置1-2小時(shí)，最后轉入-80 ℃放置過(guò)夜，最終轉入液氮保存。需要短期保存的，直接放-80 ℃也行?，F在市場(chǎng)上有比較貴的凍存盒，把需要存放的細胞放進(jìn)去，然后直接放-80 ℃就行，等時(shí)間夠長(cháng)后直接轉至液氮中即可。

（4）細胞需要保存在液氮的氣相中，而不是泡在液相里。否則液氮很容易進(jìn)入凍存管。這一點(diǎn)很多人都沒(méi)有注意，大部份人都是直接往液相里放，其實(shí)這是錯誤的。有人認為，普通的液氮中可能含有微生物或者孢子什么的，如果放在液相中，這些微生物或孢子就有機會(huì )進(jìn)入凍存管，最終可能造成細胞污染。

（5）保證被凍存的細胞處于良好的生長(cháng)狀態(tài)，并且沒(méi)有被污染。

對于復蘇過(guò)程，需要注意：

（1）快速。為了防止升溫中細胞內產(chǎn)生冰晶，強烈建議加快融化過(guò)程。一般都要用用足夠體積的37 ℃熱水復蘇，并不斷晃動(dòng)凍存管。

（2）復蘇過(guò)程不要把凍存管全部泡入水中，也不要把蓋子弄濕，否則熱水有可能污染管口，造成復蘇的細胞被污染。

（3）有的人復蘇細胞時(shí)，沒(méi)有去掉凍存液，這樣就把凍存液里的DMSO帶到了新的培養體系里，容易對細胞造成毒害，因此強烈建議將融化的細胞離心后去掉凍存液，然后用新的完全培養基重懸，再接種到新的容器內培養。

8.  為什么我的細胞總是污染？如何可以救活污染的細胞？

答：養細胞出現污染，幾乎是每個(gè)細胞培養技術(shù)員容易出現的問(wèn)題。要防止細胞污染，無(wú)非就是保證培養環(huán)境無(wú)污染，保證所用的所有試劑都無(wú)污染源，同時(shí)提高操作時(shí)的警惕性，這些基本的知識這里就不再廢話(huà)了。下面講一講如何挽救一株已經(jīng)被污染的細胞株。

（1）體外用抗生素消滅。一般來(lái)說(shuō)，一旦發(fā)現細胞被微生物污染，應該馬上進(jìn)行處理，也許還有一線(xiàn)挽救的機會(huì )。 但是這種挽救不是盲目的，首先應該決斷是哪一類(lèi)生物造成的污染。細胞的污染大致可以分三類(lèi)：細菌污染、真菌污染和支原體污染。 在顯微鏡下仔細觀(guān)察，這三種微生物污染區別還是比較明顯的：如果有大量運動(dòng)的微生物，且形態(tài)較大，輪廓清晰可見(jiàn)，呈較大幅度運動(dòng)，并且培養基在短時(shí)間內變酸，則很可能是細菌污染；如果在顯微鏡下觀(guān)察有典型的斑狀或絲狀微生物（注意與塑料屑、棉花屑和琉璃纖維區別開(kāi)），基本上看不到明顯的運動(dòng)，則很可能是真菌污染；如果看不到明顯的微生物，并且培養基沒(méi)有明顯的顏色上的變化，而細胞狀態(tài)很差，細胞邊緣極其不光滑，而且細胞又莫名其妙地死亡或生長(cháng)極其緩慢，則有可能為支原體污染，但不能下明確的結論，如果非常需要知道是否為支原體污染可以使用相關(guān)的試劑盒進(jìn)行檢測。 對于細菌或真菌的污染，可以先把細胞收集起來(lái)，用干凈的培養基洗滌離心，交替進(jìn)行幾次，再把洗干凈的細胞放在新的培養板或培養瓶等容器內，加高濃度的抗生素培養，同時(shí)強烈建議加入小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養層，以輔助消除微生物。對于細菌污染，可以把青霉素的濃度提高至10倍左右，鏈霉素濃度提高至5-10 倍，也可以用10倍濃度的卡那霉素替代鏈霉素。 對于真菌污染，可以在培養基中加入約5 ug/ml的咪康唑（注射用達克寧）抑制。 對于這兩種情況的污染，采用上述方法處理后，待細胞稍有好轉，并且沒(méi)有發(fā)現更大規模的污染時(shí)，需要盡快重復上面的處理步驟。需要注意的是，此時(shí)細胞生長(cháng)受抗生素的影響比較大故而生長(cháng)很慢。如果多次傳代均未發(fā)現污染復發(fā)，可以慢慢降低抗生素濃度直至常規濃度，確定是否完全根除污染。最好進(jìn)行一次有限稀釋的亞克隆操作，以獲得更加純凈的細胞株。 而對于支原體污染，則比較麻煩，一般的抗生素是很難解決的，對于輕度的污染，可以試試使用60 ug/ml的泰樂(lè )菌素和10 ug/ml左右的環(huán)丙沙星交替處理。如果得到明顯的緩解，建議馬上做亞克隆操作，看看是否得到污染根除的細胞株，如果此方法無(wú)效，則不能單純利用抗生素來(lái)解決污染問(wèn)題。

（2）體內法。這個(gè)辦法很簡(jiǎn)單，原理就是動(dòng)物體有強大的免疫系統，一般的微生物都可以被動(dòng)物體消滅。具體操作和制備腹水的方法完全一樣，即先用IFA或石蠟制敏小鼠，數天后腹腔注射污染的雜交瘤。如果情況緊急，致敏當天注射雜交瘤也行。一般十天后小鼠產(chǎn)生腹水，在超凈臺無(wú)菌采出腹水，其中即含有大量的雜交瘤細胞，一般是可以除掉污染的微生物的。也可以在小鼠背部注射雜交瘤，十幾天后可以看到實(shí)體瘤形成，也可以在超凈臺上無(wú)菌采摘，然后放回培養板或培養瓶等容器內培養。如果被污染的細胞很少，比如說(shuō)在96孔板上就被污染了，這時(shí)候不能進(jìn)行腹腔注射，也不要進(jìn)行皮下注射，否則細胞很容易被老鼠的免疫系統攻擊而死亡的，最好的辦法是采用脾內注射的方法進(jìn)行，同時(shí)在腹腔內用IFA或石蠟油致敏，十幾天后，同樣可以形成腹水，其中即含有干凈的雜交瘤細胞。 如果擔心小鼠會(huì )受到微生物感染，可以在培養基中先加入高濃度的抗生素，然后連同抗生素一起注射到小鼠體內。

如果確定細胞污染極其嚴重，并且細胞已大面積死亡，建議放棄，迅速做好環(huán)境清潔工作，對細胞操作間作徹底消毒，重新做融合而獲得新的細胞株，不可因小失大造成其它的細胞也被污染。

9.  為什么我的雜交瘤細胞不能制備腹水或者制備的腹水中沒(méi)的抗體或腹水沒(méi)有效價(jià)？

答： 不能制備腹水的原因大部份是人為的原因：

（1）致敏不正確，例如使用了不正確的致敏劑，或者致敏時(shí)間與接種雜交瘤的時(shí)間相差太久。

（2）雜交瘤的接種位置不正確，沒(méi)有打到腹腔，而是打到了皮下。

（3）接種的雜交瘤細胞數量太少或者細胞狀態(tài)不好。一般不應少于10萬(wàn)個(gè)細胞，建議在100萬(wàn)個(gè)細胞左右為宜。

（4）制備腹水小鼠的種系與參與融合的細胞來(lái)源的動(dòng)物種系相差太遠，以至制備腹水的小鼠對雜交瘤有強大的免疫反應將其殺死，建議更換小鼠品系重新接種。

對于腹水沒(méi)有效價(jià)，可能的原因：

（1）制備腹水的雜交瘤極不穩定，打到小鼠身上之前就失去抗體分泌能力或者打到腹腔內就失去了分泌能力。

（2）致敏小鼠時(shí)采用了錯誤的致敏劑，如使用了弗氏完全佐劑，這時(shí)即使不打雜交瘤，小鼠也會(huì )產(chǎn)生腹水。

（3)極其罕見(jiàn)的情況，就是此雜交瘤生產(chǎn)的抗體可以與小鼠體內的分子相互作用，于是雜交瘤產(chǎn)生的抗體被小鼠的相關(guān)蛋白中和，這種情況下，小鼠的身體可能會(huì )出現明顯的異常。

（4）檢測腹水效價(jià)的實(shí)驗方案有問(wèn)題，或者腹水稀釋比過(guò)大。

10.  免疫失敗的可能原因及應采取的措施

答：有時(shí)不能獲得滿(mǎn)意的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進(jìn)之。

（1）免疫動(dòng)物的種屬及品系是否合適，可考慮改變動(dòng)物的種屬或品系，或擴大免疫動(dòng)物的數量。

（2） 抗原質(zhì)量是否良好，可改用其它廠(chǎng)家的產(chǎn)品或改用同一廠(chǎng)家的其它批號，也可考慮改變抗原分子的部分結構，或改進(jìn)提取方法。

（3） 制備的免疫原是否符合要求，可從偶聯(lián)劑，載體、抗原或載體的比例、反應時(shí)間等多方面去考慮，并加以改進(jìn)。

（4） 所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強乳化。

（5） 免疫的方法、劑量，加強免疫的間隔時(shí)間和次數，免疫的途徑是否合適。

（6） 動(dòng)物的飼養是否得當，如營(yíng)養（飼料、飲水）、環(huán)境衛生（通風(fēng)、采光、溫度）是否符合要求，動(dòng)物的健康情況是否良好等。

11.  制備單克隆抗體影響因素、失敗原因分析

答：由于制備McAb的實(shí)驗周期長(cháng)，環(huán)節多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會(huì )造成失敗。 其主要失敗原因和影響因素有：

（1）污染： 包括細菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中最辣手的問(wèn)題。一旦發(fā)現有霉菌污染就應及早將污染板棄之，以免污染整個(gè)培養環(huán)境。支原體的污染主要來(lái)源于牛血清，此外，其它添加劑、實(shí)驗室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。在有條件的實(shí)驗室，要對每一批小牛血清和長(cháng)期傳代培養的細胞系進(jìn)行支原體的檢查，查出污染源應及時(shí)采取措施處理。對于污染的雜交瘤細胞可以采取生物學(xué)的過(guò)濾方法，將污染的雜交瘤細胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待長(cháng)出腹水或實(shí)體瘤時(shí)，取出分離雜交瘤細胞，一般可除去支原體污染。

（2）融合后雜交瘤不生長(cháng)， 在保證融合技術(shù)沒(méi)有問(wèn)題的前提下主要考慮下列因素：

PEG有毒性或作用時(shí)間過(guò)長(cháng)。

牛血清的質(zhì)量太差，用前沒(méi)有進(jìn)行嚴格的篩選。

骨髓瘤細胞污染了支原體。

HAT有問(wèn)題，主要是A含量過(guò)高或HT含量不足。

（3）雜交瘤細胞不分泌抗體或停止分泌抗體： 融合后有細胞生長(cháng)，但無(wú)抗體產(chǎn)生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細胞發(fā)生突變，變成A抵抗細胞所致。 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。 對于原分泌抗體的雜交瘤細胞變?yōu)殛幮?，可能是細胞支原體污染，或非抗體分泌細胞克隆競爭性生長(cháng)，從而 抑制了抗體分泌細胞的生長(cháng)。也可能發(fā)生染色體丟失。Goding91982）曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗體停止分泌的有效措施。

三要：

要大量保持和補充液氮凍存的細胞原管。

要應用倒置顯微鏡經(jīng)常檢查細胞的生長(cháng)狀況。

要定期進(jìn)行再克隆。

三不要：

不要讓細胞“過(guò)度生長(cháng)”。因為非分泌的雜交瘤細胞將成為優(yōu)勢，壓倒分泌抗體的雜交瘤細胞。

不要讓培養物不加檢查地任其連續培養幾周或幾個(gè)月。

不要不經(jīng)克隆化而使雜交瘤在機體內以腫瘤生長(cháng)形式連續傳好幾代。

（4）雜交瘤細胞難以克隆化

可能與小牛血清質(zhì)量、雜交瘤細胞的活性狀態(tài)有關(guān)，或由于細胞有支原體污染，使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆化，應在培養液加HT。

本文關(guān)鍵詞：單抗制備常見(jiàn)問(wèn)題分析